In vitro Zytotoxizitätstest mit XTT-Farbstoff (Mauszelllinie L929)
Kontaktieren Sie unsDer XTT-Test basiert auf der Spaltung des gelben Tetrazoliumsalzes XTT zu einem orangefarbenen wasserlöslichen Formazanprodukt durch die Dehydrogenaseaktivität in den aktiven Mitochondrien.
Eine Abnahme der Zahl der lebenden Zellen führt zu einer Abnahme der Gesamtaktivität der mitochondrialen Dehydrogenasen in der Probe. Diese Abnahme korreliert direkt mit der Menge des gebildeten orangefarbenen Formazans, das durch die Absorption gemessen wird.
Mit dem XTT-Test werden die Zellproliferation und die Lebensfähigkeit der Zellen nach Behandlung mit dem Testgegenstand kolorimetrisch bestimmt.
Bewertung der mitochondrialen Dehydrogenase-Aktivität durch Extraktionsmethode und XTT-Farbstoff
- Der Prüfgegenstand wird unter Schütteln für eine bestimmte Zeit in DMEM, ergänzt mit 10% FBS, bei 37 ± 1°C extrahiert und L929-Zellen werden mit dem Extrakt inkubiert.
- Kurz vor Ende der Inkubationszeit werden die Zellen mikroskopisch ausgewertet und das XTT-Reagenz sowie ein Elektronenkopplungsreagenz zugegeben. Die Zellen werden weitere 1 - 2 Stunden bebrütet und die Absorption wird bei 450 nm (Referenzwellenlänge 650 nm) bestimmt.
- Eine Dehydrogenaseaktivität von weniger als 70 % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollkulturen (Lösungsmittelkontrolle) wird als eindeutige zytotoxische Wirkung gemäß ISO 10993-5 angesehen.
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Protokoll |
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Zelllinie |
L929-Zellen (ATCC Nr. CCL1, NCTC-Klon 929 (Bindegewebsmaus), Klon von Stamm L (DSMZ)) |
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Analyse |
Der XTT-Test beruht auf der Spaltung des gelben Tetrazoliumsalzes XTT zu einem orangefarbenen wasserlöslichen Formazanprodukt durch Dehydrogenaseaktivität in aktiven Mitochondrien |
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Konzentrationen |
4 Konzentrationen des Testextrakts: 29,6%, 44,4%, 66,7% und 100% |
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Extraktionszeit |
4 - 72 h bei 37 ± 1°C - 4 h (kurzfristiger Kontakt und intakte Haut oder Schleimhaut) |
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Inkubationszeit |
24 - 72 h bei 37 ± 1°C |
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Qualitätskontrollen |
Lösungsmittel-Kontrolle: DMEM 10% FBS Negative Kontrolle: Polypropylen extrahiert in DMEM 10% FBS Positive Kontrolle: Latex extrahiert in DMEM 10 % FBS |
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Lieferung von Daten |
Die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenase wird durch die Absorption bei 450 nm (Referenzwellenlänge 650 nm) bestimmt. |
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Positive Vorhersage |
Eine Dehydrogenase-Aktivität von weniger als 70 % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollkulturen (Lösungsmittelkontrolle) gilt als eindeutig zytotoxische Wirkung. |
Referenzen
- Scudiero, P. A.; Shoemaker, R. H.; Paull, K. D.; Monks, A.; Thierney, S.; Nofziger, T. ; Currens, M. J.; Seniff, D.; Boyd, M. R.: 1988, “Evaluation of a soluble Tetrazolium/Formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines“. Cancer Res., 48, 4827 – 4833
- ISO 10993-5: 2009, “Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity“
- ISO 10993-12: 2012, “Biological evaluation of medical devices – Part 12: Sample preparation and reference materials“
