In vitro Zytotoxizitätstest mit MTT-Farbstoff (Mauszelllinie L929)
Kontaktieren Sie unsDer MTT-Test beruht auf der Spaltung des gelben Tetrazoliumsalzes MTT unter Bildung eines violetten Formazans. Eine Abnahme der Zahl der lebenden Zellen führt zu einer Abnahme der Stoffwechselaktivität in der Testkultur. Diese Abnahme korreliert direkt mit der Menge des gebildeten violetten Formazans, das durch die Absorption gemessen wird.
Mit dem MTT-Test wird die Zellproliferation sowie die Lebensfähigkeit der Zellen nach Behandlung mit dem Prüfgegenstand kolorimetrisch bestimmt.
Bewertung der Zellviabilität durch Extraktionsmethode und MTT-Farbstoff
- Der Prüfgegenstand wird unter Schütteln für eine bestimmte Zeit in DMEM, ergänzt mit 10% FBS, bei 37 +/- 1°C extrahiert und L929-Zellen werden mit dem Extrakt inkubiert.
- Kurz vor Ende der Inkubationszeit werden die Zellen mikroskopisch beurteilt und das MTT-Reagenz zugegeben. Die Zellen werden etwa 2 Stunden lang bebrütet. Danach wird in jede Vertiefung eine Solubilisierungslösung (HCl) gegeben und die Absorption bei 570 nm (Referenzwellenlänge 650 nm) bestimmt.
- Eine Lebensfähigkeit der mit dem Testextrakt behandelten Kulturen von weniger als 70 % im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollkulturen (Lösungsmittelkontrolle) wird gemäß ISO 10993-5 als eindeutige zytotoxische Wirkung angesehen.
Protokoll |
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Zelllinie |
L929-Zellen (ATCC Nr. CCL1, NCTC-Klon 929 (Bindegewebsmaus), Klon von Stamm L (DSMZ)) |
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Analyse |
Der MTT-Test beruht auf der Spaltung des gelben Tetrazoliumsalzes MTT unter Bildung eines violetten Formazans |
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Konzentrationen |
4 Konzentrationen des Testextrakts: 29,6%, 44,4%, 66,7% und 100% |
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Extraktionszeit |
4 - 72 h bei 37 ± 1°C - 4 h (kurzfristiger Kontakt und intakte Haut oder Schleimhaut) |
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Inkubationszeit |
24 - 72 h bei 37 ± 1°C |
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Qualitätskontrollen |
Lösungsmittel-Kontrolle: DMEM 10% FBS Negative Kontrolle: Polypropylen extrahiert in DMEM 10% FBS Positive Kontrolle: Latex extrahiert in DMEM 10 % FBS |
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Lieferung von Daten |
Die Lebensfähigkeit der Zellen wird anhand der Absorption bei 570 nm (Referenzwellenlänge 650 nm) bestimmt. |
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Positive Vorhersage |
Eine Lebensfähigkeit der mit dem Testextrakt behandelten Kulturen von weniger als 70 % im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollkulturen (Lösungsmittelkontrolle) wird als eindeutige zytotoxische Wirkung angesehen. |
Referenzen
- Scudiero, P. A.; Shoemaker, R. H.; Paull, K. D.; Monks, A.; Thierney, S.; Nofziger, T. H.; Currens, M. J.; Seniff, D.; Boyd, M. R.: 1988, “Evaluation of a soluble Tetrazolium/Formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines“. Cancer Res., 48, 4827 – 4833
- ISO 10993-5: 2009, “Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity“
- ISO 10993-12: 2012, “Biological evaluation of medical devices – Part 12: Sample preparation and reference materials“
