HPRT-Test in vitro

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Dieser In-vitro-Versuch wurde durchgeführt, um das Potenzial des Prüfgegenstands zur Auslösung von Genmutationen mit Hilfe eines HPRT-Tests (Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase) an der Zelllinie des chinesischen Hamsters V79 zu bewerten. Mit dem HPRT-System werden Basenpaar-Mutationen, Frameshift-Mutationen sowie kleine Deletionen und Insertionen nachgewiesen.

Der Test wird in Übereinstimmung mit der OECD-Richtlinie für die Prüfung von Chemikalien, Abschnitt 4, Nr. 476 bei Eurofins BioPharma Product Testing Munich GmbH ¹) mit Chemikalien und Arzneimitteln durchgeführt.

Weitere Tests zur Mutagenität sind der Reverse Mutation Assay (mit Bakterien) und der Mouse Lymphoma Assay (mit Säugetierzellen).

Experimentelle Leistung

Protokoll
Zelllinie	Chinesischer Hamster V79-Zelle
Endpunkt	Nachweis von Genmutationen Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen durch relatives Überleben
Konzentrationen	Mindestens 4 Prüfgegenstandskonzentrationen werden in einer einzigen Kultur untersucht Höchstkonzentrationen: - Chemikalien: 2 mg/mL, 2 µL/mL oder 10 mM, je nachdem, welche Konzentration die niedrigste ist (5 mg/mL für nicht definierte Komponenten/ UVCB) - Pharmazeutika: 0,5 mg/mL oder 1 mM, je nachdem, welche Konzentration am niedrigsten ist
Belichtungszeit	Kurzzeit-Inkubation für 4 h
Aktivierung des Stoffwechsels	5% Rattenleberhomogenat S9
Qualitätskontrollen	Negativkontrolle: Zellkulturmedium Positivkontrollen: Ethylmethansulfonat, 7,12-Dimethylbenz(a)anthracen
Fahrzeuge mit Testchemikalien	Zellkulturmedium, 1% Dimethylsulfoxid, 10% physiologische Kochsalzlösung, 0,5% Tetrahydrofuran, 0,5% Ethanol
Datenerfassung	Zählung der Kolonien

Testprinzip

Um die mutagene Wirkung einer Substanz mit Hilfe des HPRT-Tests abzuschätzen, wird die Koloniebildungsfähigkeit von V79-Zellen durch Zugabe von 6-Thioguanin (TG) zum Kulturmedium untersucht. Mutagene Substanzen verursachen eine Vorwärtsmutation in dem Gen, das für das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT) kodiert. Mutationen in diesem Gen führen zu einer fehlerhaften Expression der Enzymsequenz und damit zum Verlust ihrer Funktion, die für die Nukleotidsynthese über den Salvage-Weg erforderlich ist.

Zellen können Nukleotide entweder durch de-novo-Biosynthese oder über energiesparende Recyclingwege (Salvage Pathway) unter Verwendung freier Basen (z. B. Adenin, Guanin) gewinnen.

V79-Zellen mit intaktem hprt-Gen bauen das toxische Purinbasenanalogon TG über den Salvage-Weg in ihre DNA ein, was zu einer Hemmung des Zellstoffwechsels und Zytotoxizität führt (Abbildung 1).

Der Verlust der Funktion des HPRT-Enzyms aufgrund von Mutationen führt zu einer erhöhten De-novo-Synthese, da der Salvage-Weg ausgeschlossen ist. Betroffene V79-Zellen sind daher nicht in der Lage, toxisches TG in die DNA einzubauen. Daher können sich mutierte Zellen in Gegenwart von TG vermehren, während normale Zellen, die HPRT enthalten, dies nicht können.

Abbildung 1: Schema des Prüfherrn

Testverfahren

Erstes Experiment (Kurzzeitinkubation)
Ca. 2 - 6 x 10⁶ Zellen pro Behandlungsgruppe werden in vollständigem Kulturmedium ausgesät
Ca. 24 Stunden nach der Aussaat werden die Zellen entweder mit oder ohne Stoffwechselaktivierung bestimmten Konzentrationen des Prüfgegenstandes ausgesetzt. Nach 4 Stunden werden die Kulturen auf Ausfällung geprüft und das Behandlungsmedium mit dem Prüfgegenstand entfernt. Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen, trypsinisiert und mit einem Zellzähler gezählt.
Ausdruck:		Überleben:
Eine Zellkulturflasche wird mit mindestens 2 x 10⁶ Zellen pro Behandlungsgruppe in vollständigem Kulturmedium ausgesät.		Für jede Behandlungsgruppe werden zwei Kolben mit ca. 200 Zellen in vollständigem Kulturmedium ausgesät.
Die Zellen werden innerhalb der folgenden (7 - 9) Tage nach der Behandlung in vollständigem Kulturmedium in einer ausreichenden Anzahl von Zellen (mindestens 2 x 10⁶ Zellen pro Behandlungsgruppe) subkultiviert.		Nach einer angemessenen Inkubationszeit (6 - 7 Tage) werden die Kolonien mit Methanol fixiert, mit Giemsa angefärbt und gezählt.
Mutantenfrequenz:	Effizienz der Klonierung:
Am Ende der Expressionszeit (nach 7 - 9 Tagen) werden etwa 4 x 10⁵ Zellen für jede Behandlungsgruppe in 5 Zellkultur-Petrischalen mit 6-Thioguanin-haltigem Selektivmedium zur weiteren Inkubation ausgesät.	Am Ende der Expressionszeit (nach 7 - 9 Tagen) werden für jede Behandlungsgruppe zwei Kolben mit ca. 200 Zellen in vollständigem Kulturmedium ausgesät.
Nach einer angemessenen Inkubationszeit (9 - 11 Tage) werden die Kolonien mit Methanol fixiert, mit Giemsa angefärbt und gezählt.	Nach einer angemessenen Inkubationszeit (6 - 8 Tage) werden die Kolonien mit Methanol fixiert, mit Giemsa angefärbt und gezählt.

HPRT_Mutagenic Concentration

Abbildung 2: linke Seite: nicht mutagene Konzentration / rechte Seite: mutagene Konzentration

Historische Laborkontrolldaten der Negativkontrolle
	Negative Kontrolle Anzahl der Mutanten/10⁶ Zellen
Mean	-S9	+S9
Min	26	27
Max	5	8
SD	43	54
RSD [%]	8.43	9.02
n =	32.94	33.08
LCL	86	92
UCL	8.7	9.2

Mittelwert: Mittelwert der Mutanten/10⁶ Zellen

Min.: Minimum der Mutanten/10⁶ Zellen

Max.: Maximum der Mutanten/10⁶ Zellen

SD: Standardabweichung

RSD: relative Standardabweichung

n: Anzahl der Kontrollwerte

LCL: untere Kontrollgrenze

UCL: obere Kontrollgrenze

Bewertung der Mutagenität

Eine Prüfchemikalie gilt als eindeutig positiv, wenn unter einer der untersuchten Versuchsbedingungen

mindestens eine der Prüfkonzentrationen einen statistisch signifikanten Anstieg im Vergleich zur gleichzeitigen Negativkontrolle aufweist,
der Anstieg konzentrationsabhängig ist, wenn er mit einem geeigneten Trendtest ausgewertet wird, und
eines der Ergebnisse außerhalb der Verteilung der historischen Daten der Negativkontrolle liegt.
Liegt zufällig eine niedrige Spontanmutationshäufigkeit in den entsprechenden Negativ- und
Lösungsmittelkontrollen vor, so ist eine konzentrationsbedingte Zunahme der Mutationen in deren Bereich zu diskutieren.

Bedeutung

Der HPRT-Test kann den Maus-Lymphom-Assay als Teil einer Testbatterie ersetzen, wenn nach der Behandlung eine Ausfällung des Testgegenstands beobachtet wird.

Referenzen

OECD Guideline for Testing of Chemicals, Section 4, No. 476, "In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests using the Hprt and xprt genes" adopted July 29, 2016.
Bradley, M.O., B. Bhuyan, M.C. Francis, R. Langenbach, A. Peterson and E. Huberman (1981). Mutagenesis by chemical agents in V79 Chinese hamster cells: a review and analysis of the literature. A report of the gene-tox program. Mutat. Res. 87, 81-142

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