In vitro Zytotoxizitätstest mit BCA-Färbung (Mauszelllinie L929)
Kontaktieren Sie unsDie BCA-Reagenzien bestehen aus einer wasserlöslichen und stabilen BCA (Bicinchoninsäure) und einer alkalischen Cu2+-Lösung.
Die Aminosäuren Cystein, Cystin, Tryptophan und Tyrosin - die Bestandteil jeder Zelle sind - binden an diese Reagenzien und reduzieren dabei Cu2+ zu Cu+. Cu+ bindet sich dann an die Bicinchoninsäure und bildet einen wasserlöslichen violetten Farbstoff.
Die Intensität des violetten Farbstoffs korreliert mit der Zellzahl in der Kultur, die anhand der Absorption gemessen wird.
Bewertung der Wachstumshemmung von Zellen durch Extraktionsverfahren und BCA-Färbung
- Der Prüfgegenstand wird unter Schütteln für eine bestimmte Zeit in DMEM, ergänzt mit 10% FBS, bei 37 ± 1°C extrahiert und L929-Zellen werden mit dem Extrakt inkubiert.
- Kurz vor Ende der Inkubationszeit werden die Zellen mikroskopisch ausgewertet.
- Nach der Inkubation werden die Zellen mit einem Puffer gewaschen und anschließend werden die BCA-Reagenzien zugegeben. Die Zellen werden mit diesen Reagenzien 0,5 bis 2 Stunden lang inkubiert, und die Absorption wird bei 550 nm bestimmt.
- Nach ISO 10993-5 können zytotoxische Wirkungen anhand des Proteingehalts der Kulturen bewertet werden, der als Maß für das Zellwachstum verwendet wird. Eine Wachstumshemmung der mit dem Testextrakt behandelten Kulturen von mehr als 30 % im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollkulturen (Lösungsmittelkontrolle) wird als eindeutige zytotoxische Wirkung angesehen.
Protokoll |
|
|
Zelllinie |
L929-Zellen (ATCC Nr. CCL1, NCTC-Klon 929 (Bindegewebsmaus), Klon von Stamm L (DSMZ)) |
|
Analyse |
Der BCA-Assay besteht aus zwei Reaktionen: 1. Protein-Peptidbindungen reduzieren Cu2+-Ionen zu Cu+ 2. Zwei Bicinchoninsäuremoleküle bilden ein Chelat mit einem Cu+-Ion, wodurch ein violetter Komplex entsteht, der Licht mit einer Wellenlänge von 550 nm absorbiert |
|
Konzentrationen |
4 Konzentrationen des Testextrakts: 29,6%, 44,4%, 66,7% und 100% |
|
Extraktionszeit |
4 - 72 h bei 37 ± 1°C - 4 h (kurzfristiger Kontakt und intakte Haut oder Schleimhaut) |
|
Inkubationszeit |
24 - 72 h bei 37 ± 1°C |
|
Qualitätskontrollen |
Lösungsmittel-Kontrolle: DMEM 10% FBS Negative Kontrolle: Polypropylen extrahiert in DMEM 10% FBS Positive Kontrolle: Latex extrahiert in DMEM 10 % FBS |
|
Lieferung von Daten |
Die Wachstumshemmung von L929-Zellen wird durch Messung des Proteingehalts bei einer Absorption von 550 nm bestimmt |
|
Positive Vorhersage |
Eine Wachstumshemmung der mit dem Testextrakt behandelten Kulturen von mehr als 30 % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollkulturen (Lösungsmittelkontrolle) gilt als eindeutige zytotoxische Wirkung. |
Referenzen
- Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, A.K., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M. Olson B.J. and Klenk D.C: 1985, “Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid.“, Analytical Biochemistry 150, 76 – 85
- ISO 10993-5: 2009, “Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity“
- ISO 10993-12: 2012 “Biological evaluation of medical devices – Part 12: Sample preparation and reference materials”
