In vitro Zytotoxizitätstest: Koloniebildungsassay (Hamsterzelllinie V79)
Kontaktieren Sie unsBei diesem Test wird die Zytotoxizität der aus dem Prüfgegenstand freigesetzten auslaugbaren Substanzen anhand der Koloniebildungsfähigkeit nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen des Prüfgegenstandsextrakts im Vergleich zu den Kontrollen beurteilt.
Die Verdünnung, die die Koloniebildung auf 50 % reduziert (IC50), kann bestimmt werden, indem die relativen Koloniebildungsraten (%) gegen die Verdünnungen der Extrakte (%) aufgetragen werden.
Die mittlere Anzahl der in den mit frischem Kulturmedium behandelten Kulturen gebildeten Kolonien stellt die absolute Koloniebildungsfähigkeit der Zellen dar, die die Überlebensrate der Zellen nach Passage und Aussaat in den Kulturplatten widerspiegelt (100%-Kontrolle).
Bewertung der Zytotoxizität durch Koloniebildungsfähigkeit
- Der Prüfgegenstand wird für eine bestimmte Zeit bei 37 ± 1°C mit Zellkulturmedium extrahiert und V79-Zellen werden mehrere Tage lang mit dem Extrakt bebrütet.
- Nach der Inkubationszeit werden die Kulturen mikroskopisch betrachtet und sorgfältig mit PBS-Puffer gewaschen. Nach der Fixierung mit Methanol werden die Kolonien mit Giemsa-Färbelösung angefärbt.
- Die gefärbten Kolonien werden bei Raumtemperatur getrocknet. Die Kolonien, die aus mehr als 50 Zellen bestehen, werden manuell gezählt.
Prüfgegenstand Akzeptanzkriterien:
- IC50 Akzeptanzgrenze nach MHLW: ≥ 90%
- Eine Verringerung der relativen Plating-Effizienz bei einer Konzentration von 100 % der Testlösung um mehr als 30 % wird als zytotoxische Wirkung angesehen.
Protokoll |
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Zelllinie |
V79-Zellen (ATCC, CCL-93). |
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Analyse |
Die mittlere Anzahl der in den Kulturen gebildeten Kolonien stellt die absolute Koloniebildungsfähigkeit der Zellen dar, die die Überlebensrate nach Behandlung mit dem Prüfgegenstand widerspiegelt. |
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Konzentrationen |
6 Konzentrationen des Testextrakts |
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Extraktionszeit |
24 h bei 37 ± 1°C |
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Inkubationszeit |
6 - 7 Tage bei 37 ± 1°C |
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Qualitätskontrollen |
100%ige Kontrolle: Frisches MEM 10% FBS Lösungsmittel-Kontrolle: MEM 10% FBS Negativkontrolle: Polyethylen hoher Dichte, extrahiert in MEM 10% FBS Positive Kontrollen: ZDEC- und ZDBC-Polyurethanfolie, extrahiert in MEM 10% FBS |
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Lieferung von Daten |
Fähigkeit zur Koloniebildung |
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Positive Vorhersage |
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Referenzen
- ISO 10993-12: 2012 “Sample preparation and reference materials”
- MHLW (Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan) Notification by Director of OMDE Yakushokuki-hatsu No. 0301-20, “Basic Principles of Biological Safety Evaluation Required for Application for Approval to Manufacture/Market Medical Devices”, March 1, 2012
- MHLW (Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan) Ministerial Notification by Director of Health, Labour and Welfare Yasuhisa Shiozaki No. 64, The Japanese Pharmacopoeia, Seventeenth Edition, March 07, 2016, chap.7.03, 4. “Cytotoxictity test”
